جزوه آشنایی با مهارتهای پایه ژنتیک مولکولی

بخشی از متن فایل
طراحي پرايمر
قواعد مشخصي براي اين که بتوان با اطمينان يک جفت پرايمر موثّر را انتخاب کرد وجود ندارد. در حال حاضر پرايمر بيش از
هر عامل ديگري عامل موفقيت يا شکست در يک واکنش تکثيري است. بعضي قواعد راهنماييهاي مفيدي را در مورد
طراحي آغازگر ميکنند که در ذيل به آن ها اشاره شده است.
طول متوسط هر پرايمر بين ۱۸ -۳۱ جفت باز است. پرايمر با طول کوچک اتصال غيراختصاصي را افزايش و پرايمر
بزرگتر سرعت هيبريداسيون را کم ميکند.
مقدارC-G دو پرايمر با هم مشابه بوده و حدود ۵۱-۶۱ درصد باشد.
آغازگرها بايد از نظر مکمل بودن با هم کنترل شوند.
پرايمر دايمر يا آغازگر دوتايي يک تکثير مصنوعي است که اغلب در محصول PCR مشاهده ميشود و عبارتست از يک
قطعهِ دو رشتهاي که طول آن تقريباً به مجموع دو پرايمر نزديک است و هنگامي مشاهده ميشود که يک پرايمر توسط آنزيم
پليمراز به روي پرايمر ديگر گسترش يابد. مکانيزم واقعي که چگونه پرايمر دايمر تشکيل ميشود به درستي مشخص نيست.
پرايمرها با انتهاي مکمل َ’۳ مستعد تشکيل دايمر هستند. ضعف در آنزيم Taq باعث پليمريزاسيون مستقيم الگوي غير هدف
شود. در هر حال چنان چه پرايمر دايمر به عنوان مانعي مشاهده شود، ميتوان آن را تا حدودي با غلظت حداقل پرايمر و
آنزيم کاهش داد.
در انتهاي َ’۳ پرايمر بايد حداقلC يا G قرار گيرد. در تواليهاي پرايمرهايي که انتهايَ’۳ آنها غني از C+G ميباشد
احتمال اتصال اشتباهي افزايش مييابد.
نسبت چهار نوکلئوتيد در آغازگر حتيالمقدور يکسان باشد.
آغازگر به توالي تکرار شونده ختم نشود.
دماي Tm دو آغازگر نزديک هم باشد.
حدّ مجاز دماي اتصال پرايمر طراحي شده بايد بين ۶۵-۵۵ باشد. دماي تکثير ايدهآل ۷۲-۶۲ ميباشد.
درجه حرارتي که پرايمر به DNA الگو متصل ميشود به طول آغازگر و مقدار GC آن بستگي دارد. براي پرايمرهاي حاوي
۵۱GC %و داراي ۲۱ نوکلئوتيد، دماي ۵۵ درجه سانتيگراد پيشنهاد ميشود. براي افزايش اختصاصي عمل کردن آغازگر حتي
ممکن است دماهاي باالتري هم مورد نياز باشد.
براي اينکه هر پرايمر با رشته الگوي خودش هيبريد شود الزم نيست که عيناً و کامالً مکمل رشته الگو باشد. براي طراحي
پرايمر اغلب از برنامههاي کامپيوتري ويژه استفاده ميشود. فاصله بين پرايمرهايي که با DNAي هدف هيبريد ميشود به طور
معمول کمتر از ۱۵ کيلو باز ميباشد. در حقيقت يک کاهش اساسي در سنتز موثر هنگامي که محصول تکثير متجاوز …….